■体裁:B5版、275ページ、付録CD-ROM付
■発刊:2013/5
■ISBNコード:978-4-7813-0792-3
■シーエムシー出版

★OECDテストガイドライン収載、またはバリデーション中の試験法を多数掲載 !!
★試験原理をはじめ、試薬調整、細胞培養など実際の手技を詳細に解説 !!
★試験のデータ解析に欠かせないデータシート見本収載のCD付!!!

【監修】
小島肇夫

【著者】
小島肇夫　　　国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　薬理部　新規試験法評価室　室長
森田健　　　国立医薬品食品衛生研究所　安全情報部　室長
尾上誠良　　　静岡県立大学　薬学部　薬物動態学分野　准教授
若栗忍　　　(一財)食品薬品安全センター　秦野研究所
五十嵐良明　　　国立医薬品食品衛生研究所　生活衛生化学部　部長
山下邦彦　　　(株)ダイセル　研究統括部　コーポレート研究所　評価・解析グループ　主席研究員
篠田伸介　　　(株)薬物安全性試験センター　吉見研究所　第三試験室　室長
丸山裕子　　　富士フイルム(株)　CSR推進部　環境・品質マネジメント部　安全性評価センター
宮澤正明　　　花王(株)　安全性科学研究所
加藤雅一　　　(株)ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング　研究開発部　主幹研究員
半田由希　　　倉敷紡績(株)　バイオメディカル部　バイオ試薬課
山本直樹　　　藤田保健衛生大学　共同利用研究施設　分子生物学　准教授
吉村功　　　東京理科大学　名誉教授
榊原隆史　　　(株)化合物安全性研究所　安全性研究部　第四研究室　副主任研究員
六川潤美　　　(株)化合物安全性研究所　安全性研究部　病理検査室　副主任研究員
小坂忠司　　　(一財)残留農薬研究所　試験事業部　業務担当部長
額田祐子　　　花王(株)　安全性科学研究所　研究員
宇野芳文　　　田辺三菱製薬(株)　研究本部　安全性研究所　第一部長
武藤重治　　　田辺三菱製薬(株)　研究本部　安全性研究所　主任研究員
本間正充　　　国立医薬品食品衛生研究所　変異遺伝部　部長
髙橋祐次　　　国立医薬品食品衛生研究所　安全性生物試験研究センター　毒性部　主任研究官
渡辺美香　　　(一財)食品薬品安全センター秦野研究所　代替法試験部　細胞毒性学研究室　室長補佐
赤堀有美　　　(一財)　化学物質評価研究機構　安全性評価技術研究所　主任
武吉正博　　　(一財) 化学物質評価研究機構　安全性評価技術研究所　研究第一部長
小野敦　　　　国立医薬品食品衛生研究所　総合評価研究室　主任研究官
酒井綾子　　　(一財)食品薬品安全センター　代替法試験部　細胞発がん研究室
大森崇　　　同志社大学　文化情報学部　准教授

【刊行にあたって】
動物実験は医学・生理学の発展に大きな役割を果たすとともに、現在も人類の健康と福祉に大きく貢献しております。しかし、近年、動物実験の3Rs(Reduction : 動物実験の削減、Refinement : 実験動物の苦痛の軽減、Replacement : 動物実験の置換え)の観点から、動物実験代替法(3Rs原則を実現する試験法)の活用に向けた取り組みが世界中で行われています。特にEUでは早くからこうした動きが盛んであり、2013年3月より、動物実験を行った成分を含む化粧品の製造販売を禁止されるなど、国際化が進む中、わが国の関連企業へも大きな影響を及ぼしています。

このため、動物実験代替法にて人類の健康と福祉を確保するためには、「行政的に認められた動物実験代替法」の普及が急務となっています。しかしながら動物実験代替法に関する詳細な実験書はなく、英語で書かれた論文やOECD(経済協力開発機構)のテストガイドラインを参考にし、各社でアレンジした手法で試験をせざるをえないのが現状のようです。

こうした背景から、「動物実験代替安全性試験プロトコル集」を企画いたしました。本書籍は、各分野の専門家にOECDテストガイドラインとして承認済み、または承認間近の試験法をプロトコル形式で解説頂き、まとめて頂いたものです。

また本書籍には、試験の際に実際に使用されている「データシート」を収載したCDを付与しました。これらのデータシートを試験実施の際に使用して頂くことで、動物実験代替法の更なる普及にもつながると考えております。よろしくご利用頂けましたら幸いです。

(本書「はじめに」より)

【目次】
【第I編　動物実験代替法概論】

第1章　動物実験代替法の意義と今後
1　はじめに
2　動物実験に関する各国の状況
2.1　EU
2.2　米国の状況
3　国際機関
3.1　日米EU医薬品規制調和国際会議(ICH:International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)
3.2　化粧品国際規制会議(ICCR:International Cooperationon Cosmetics Regulations)
3.3　経済協力開発機構(OECD:Organisation for Economic Co-operation and Development)
3.4　国際標準化機構(ISO:International Organisation for Standardization)
3.5　国際獣疫事務局(OIE:World Organisation for Animal Health)
3.6　バリデーションセンター
4　おわりに


第2章　GHSにおける代替法の基準および規制の動向
1　GHSとは
2　GHSにおけるハザードコミュニケーション
3　GHSにおける健康有害性項目とOECDテストガイドライン
4　わが国のGHS導入状況と今後の対応


【第II編　安全性試験法解説】

〈光毒性試験〉
第1章　Reactive Oxygen Species(ROS)アッセイ
1　 はじめに
1.1　光線過敏症
1.2　化合物の光化学反応性と光毒性誘発リスク
2　材料および試薬
2.1　試薬
2.2　器具・機器
2.3　その他に必要とされる器具・装置
3　測定原理
4　試験方法ならびにデータ解析
5　データ採用条件
6　陽性基準
7　適用限界


第2章　In vitro　3T3 NRU phototoxicity test
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　試薬
2.3　器具・機器
2.4　その他
3　試験方法
3.1　照射条件の設定
3.2　細胞の紫外線感受性
3.3　試験に供試する被験物質の条件
3.4　被験物質の調製
4　光細胞毒性試験
4.1　1日目
4.2　2日目
4.3　3日目
4.4　データ解析
5　試験成立のための条件
6　試験における判定基準
7　適用限界
8　その他の注意事項


〈皮膚感作性試験〉
第3章　Local Lymph Node Assay(LLNA)
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　動物
2.2　試薬
2.3　器具・機器
3　試験方法
3.1　予備スクリーニング試験
3.2　本試験のスケジュール
3.2.1　第1日
3.2.2　第2日および第3日
3.2.3　第4日および第5日
3.2.4　第6日
3.2.5　第7日
4　データ採用条件
5　陽性基準
6　その他の注意事項
6.1　Local Lymph Node Assay(LLNA)
6.2　Reduced local lymph node assay(rLLNA)


第4章　LLNA:DA　
1　はじめに
1.1　試験法開発の経緯と特徴
1.2　試験の概要および本書記載の試験方法の注意点
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　試薬
2.3　器具・機器
3　試験方法
3.1　予備試験
3.1.1　被験物質の調整
3.1.2　溶媒
3.1.3　投与
3.1.4　観察
3.1.5　本試験に用いる濃度
3.2　本試験
3.2.1　1日目
3.2.2　2日および3日目
3.2.3　7日目
3.2.4　8日目
4　試験結果の判定～データの採用条件および信頼性チェック～
5　判定基準
6　適用限界
7　その他の注意事項


第5章　LLNA: BrdU-ELISA
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　使用動物
2.2　試薬
2.3　機器、器具
2.4　その他試薬、消耗品
3　試験方法
3.1　動物飼育
3.2　調製
3.2.1　被験物質
3.2.2　陽性対照物質
3.3　予備試験
3.3.1　被験物質液の耳介への塗布
3.3.2　観察・測定
3.3.3　主試験の用量設定
3.4　主試験
3.4.1　群構成
3.4.2　感作
3.4.3　BrdU投与
3.4.4　耳介リンパ節の採取
3.4.5　BrdU取り込み量の測定
3.4.6　結果の評価
4　データ採用条件
5　陽性基準
6　適用限界
7　その他の注意事項


第6章　human Cell Line Activation Test(h-CLAT)
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　フローサイトメトリー測定用試薬
2.3　機器
3　試験方法
3.1　細胞および機器の準備
3.1.1　細胞の維持
3.1.2　試験前の細胞準備
3.1.3　試薬および器具の使用にあたっての注意点
3.1.4　フローサイトメトリーの設定
3.1.5　細胞の反応性確認
3.2　濃度設定試験(細胞毒性試験)
3.2.1　1日目の方法:被験物質の調製および細胞処理
3.2.2　2日目の方法:細胞回収、フローサイトメトリー測定
3.2.3　CV75の測定と本試験の濃度設定
3.3　本試験(CD86およびCD54測定試験)
3.3.1　1日目の方法:被験物質の調製および細胞処理
3.3.2　2日目の方法:細胞回収、細胞染色
3.3.3　2日目の方法:フローサイトメトリー測定
4　データ採用条件
4.1　データ解析
4.2　試験成立の条件
4.3　各被験物質における試験データの採用基準
5　陽性基準
6　EC150、EC200の算出
6.1　EC150あるいはEC200を挟む2濃度が得られている場合(内挿法)
6.2　試験最低濃度がCD86またはCD54の陽性基準値を超えている場合(外挿法)
7　適用限界


〈皮膚刺激性試験〉
第7章　LabCyte EPI-MODEL24皮膚刺激性試験
1　はじめに
1.1　背景
1.2　試験法の原理
1.3　試験法の概要
1.4　LabCyte EPI-MODEL24
2　材料および試薬
2.1　LabCyte EPI-MODEL24の構成
2.2　試薬
2.3　機器
2.4　その他
3　試験方法
3.1　LabCyte EPI-MODEL24の前培養
3.2　被験物質の適用と洗浄
3.3　後培養
3.4　MTT反応
3.5　MTTフォルマザンの抽出と測定
4　試験の成立基準
4.1　試験適合基準1:陰性対照
4.2　試験適合基準2:陽性対照
4.3　試験適合基準3:標準偏差(SD)
5　予測モデル
6　適用限界
7　その他の注意事項


第8章　皮膚刺激性試験(EpiDerm、in vitro)
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　試薬
2.3　機器・器具
2.4　その他
3　試験方法
3.1　―0日目―　プレインキュベーション
3.2　―1日目― 試験物質曝露
3.3　―2日目― 培地交換
3.4　―3日目― MTTアッセイ
3.5　試験データ
4　試験成立条件
5　陽性基準
6　適用限界
6.1　蒸発性の高い試験物質
6.2　MTTに干渉する可能性のある試験物質
7　その他の注意事項(ナイロンメッシュの適合性(液体試験物質限定))


〈眼刺激性試験〉
第9章　フルオレセイン漏出試験法(Fluorescein leakage test method ; FL試験法)
1　はじめに
1.1　背景
1.2　試験法の位置づけ
1.3　試験法の概要
2　材料および試薬
2.1　使用細胞
2.2　試薬
2.3　試薬調整
2.4　器具・機器
3　試験方法
3.1　インサート上での細胞層の形成
3.2　被験物質の準備と曝露
3.3　蛍光物質(Na-F)の添加と測定
3.4　結果解析
4　データ採用条件
5　陽性基準
6　適用限界
7　その他
7.1　試験の実施における注意点
7.2　試験法の正確性
7.3　試験結果の再現性について
8　結論


第10章　眼腐食性および強度刺激性物質を同定するためのウシ角膜を用いる混濁度および透過性試験法
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生物材料(ウシ眼球)
2.2　試薬
2.3　器具・機器
3　試験方法
3.1　眼球の準備
3.2　被験物質の適用
3.3　暴露後のインキュベーション
3.4　対照物質
3.5　測定評価項目
4　データ採用条件
5　陽性基準
6　適用限界
7　その他の注意事項
7.1　病理組織標本の作製
7.2　ウシ眼球および角膜の処分方法


第11章　眼刺激性試験(サイトセンサーマイクロフィジオメーター法)
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1 生物材料(細胞)
2.2　培地
2.3　機器
3　試験方法
3.1　L929細胞の準備
3.2　被験物質および対照物質の適用
3.2.1　被験物質調製の準備
3.2.2　予備試験(適用濃度確認試験)
3.2.3　本試験
3.3　被験物質暴露前の準備および暴露サイクル
4　データ採取条件
5　MRD50(metabolic rate decrement of 50%)の算出
6　適応限界
7　その他の注意事項


第12章　Short Time Exposure(STE)試験
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生体材料
2.2　試薬
2.3　器具・機器
3　試験方法
3.1　試験溶媒の選択
3.2　細胞の前培養
3.3　被験物質調製
3.4　曝露・測定
3.5　細胞生存率算出
4　データ採用条件
5　陽性基準
6　適用限界
7　その他の注意事項


〈遺伝毒性試験〉
第13章　コメットアッセイ
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生物材料(供試動物)
2.2　試薬
3　試験方法
3.1　実験デザイン
3.2　動物への投与
3.3　体重測定および症状観察
3.4　組織採取
3.5　単細胞の調製
3.6　スライド標本の作製
3.7　細胞溶解(または細胞核溶解)
3.8　アンワインディングおよび電気泳動
3.9　スライド標本の中和および脱水
3.10　DNAの染色、コメットの画像化および解析
3.11　病理組織学的検査
3.12　統計学的解析
3.13　データおよび報告書作成
3.14　資料の保存
4　データ採用条件
5　結果の評価および解釈
6　適用限界
7　その他の注意事項


第14章　哺乳類細胞を用いたin vitro小核試験
1　はじめに
1.1　本試験について
1.2　最初に考慮すべき事項
1.3　試験の概要
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　試薬
3　試験方法
3.1　細胞増殖性および細胞毒性の測定、ならびに試験用量の選択
3.2　処理計画
3.3　cytoB処理を行うリンパ球、初代細胞および細胞株
3.4　cytoB処理を行わない樹立細胞株
3.5　細胞培養の数
3.6　細胞試料の回収、およびスライドの調製
3.7　分析
3.8　試験機関の習熟度の保証
4　データおよび報告
5　結果の評価および判定
6　試験報告書
補遺


〈急性毒性試験〉
第15章　急性毒性試験
1　はじめに
1.1　急性毒性試験の経緯
1.2　TG420　固定用量法　Fixed Dose Procedure
1.3　TG423　急性毒性等級法　Acute Toxic Class Method、ATC法
1.4　TG425　上げ下げ法　Up-and-Down Procedure、UDP法
1.5　OECDのTG
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　器具・機器
3　試験方法
3.1　動物種
3.2　検疫、馴化および群わけ
3.3　飼育条件
3.4　被験物質投与液の調製
3.5　給餌と飲水
3.6　投与量の算出
3.7　投与
3.8　動物数および投与用量
3.9　限度試験
3.10　観察
3.11　体重測定
3.12　病理学的検査
4　その他の注意事項
4.1　被験物質の腐蝕性の確認
4.2　初回投与量の選択について
4.3　検査項目について


第16章　コロニー形成法による細胞毒性試験
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　試薬
2.3　器具・機器
3　試験操作
3.1　被験物質の調製
3.1.1　原料化学物質の場合
3.1.2　医療機器および医薬品容器の場合
3.2　細胞播種
3.3　処理
3.4　固定・染色
3.5　コロニー計測
4　データ採用条件
5　陽性基準
6　判定基準


〈内分泌撹乱物質スクリーニング〉
第17章　hERα-HeLa-9903細胞株を用いた化学物質のエストロゲンアゴニスト活性を検出するための安定的に形質転換したヒトエストロゲン受容体αを介した転写活性化試験
1　はじめに(試験の意義や特徴)
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　試薬
2.3　器具・機器
3　試験方法
3.1　96-wellプレートへの細胞の播種
3.2　被験物質の希釈と被験物質の暴露
3.3　化学発光の測定
3.4　RPCMax、PCMax、PC10、PC50およびEC50の算出
3.4.1　RPCMax、PCMax、PC10およびPC50の算出
3.4.2　EC50の算出
4　データ採用条件
5　陽性基準
6　適用限界
7　その他の注意事項


第18章　BG1Luc細胞を用いるエストロゲン受容体転写活性化試験法
1　はじめに
2　材料および試薬
2.1　生物材料
2.2　試薬
2.3　器具・機器
3　試験方法
3.1　細胞の準備
3.1.1　培地および関連試薬の調整
3.1.2　細胞の増殖
3.1.3　アッセイ用細胞の前培養
3.1.4　細胞の安定性
3.1.5　細胞生存率の目視判定
3.2　コントロールの準備
3.2.1　ストック溶液の準備
3.2.2　用量設定試験で用いる標準液の調整
3.2.3　本試験で用いる標準液の調整
3.3　被験物質の準備
3.3.1　アゴニスト試験
3.3.2　アンタゴニスト試験
3.4　各試験施設における背景データベースの構築
3.5　技術実証試験
3.6　発光強度の測定
3.7　用量設定試験
3.7.1　プレートデザイン
3.7.2　アゴニスト用量設定試験の評価
3.7.3　アンタゴニスト用量設定試験の評価
3.8　本試験
4　試験結果の採用基準
4.1　アゴニスト用量設定試験
4.2　アゴニスト本試験
4.3　アンタゴニスト用量設定試験
4.4　アンタゴニスト本試験
5　データ解析と陽性(陰性)判定基準
5.1　データ解析
5.2　用量設定試験
5.2.1　アゴニストアッセイ
5.2.2　アンタゴニストアッセイ
5.3　本試験
5.3.1　アゴニストアッセイ
5.3.2　アンタゴニストアッセイ
5.4　陽性(陰性)判定基準
5.4.1　アゴニストアッセイ
5.4.2　アンタゴニストアッセイ
5.5　EC50/IC50の算出
5.6　はずれ値の判定
5.7　結果報告書
6　適用限界
7　その他の注意事項


〈がん原性物質のスクリーニング〉
第19章　Bhas 42細胞形質転換試験
1　はじめに
1.1　2段階発がんと2段階細胞形質転換
1.2　Bhas 42細胞とBhas 42細胞形質転換試験
1.3　6-ウェル法と96-ウェル法
2　Bhas CTAの構成
3　材料および試薬
3.1　細胞
3.2　培地
3.3　試薬
3.4　器具および装置
4　準備
4.1　培養
4.2　細胞の凍結保存
4.3　細胞の適性検査
4.4　FBSの選択
4.5　被験物質と溶媒
4.6　被験物質の濃度
4.7　陰性対照と陽性対照
5　試験方法
5.1　イニシエーション試験
5.1.1　細胞増殖試験
5.1.2　形質転換試験のための濃度設定
5.1.3　形質転換試験
5.2　プロモーション試験
5.2.1　細胞増殖試験
5.2.2　形質転換試験のための濃度設定
5.2.3　形質転換試験
6　結果の評価
6.1　形質転換頻度の記録
6.2　統計解析
6.3　データ採用条件(許容基準)
6.3.1　同時実施の細胞増殖試験
6.3.2　形質転換試験
6.4　結果の判定
7　注意事項


〈統計学〉
第20章　バリデーション研究におけるデータマネージメント
1　はじめに
2　データクリーニング
3　間違いの事前防止
4　実験実施委員会と計画書
5　実験結果の再現性
6　図表示の利用例
7　GLP準拠について
8　プロトコル変更について
9　データの保存と公開